Biologische Proben & Zellaufschluss

Vom Zellaufschluss bis zur Pulverisierung und Homogenisierung unterschiedlichster biologischer Proben

Die Aufbereitung von biologischen Proben wie Knochen, Pflanzen, Muskeln oder Sputum für die Analyse von DNA, RNA, Proteinen oder Metaboliten kann eine Herausforderung darstellen. RETSCH bietet Labormühlen, die Feststoffproben pulverisieren und homogenisieren, aber auch für den Zellaufschluss geeignet sind. RETSCH Mühlen werden u.a. in der Biotechnologie, Diagnostik, Forensik, Landwirtschaft und Mikrobiologie eingesetzt.

Zellaufschluss von Mikroorganismen (in Suspension)

Der Zellaufschluss ist häufig die Methode der Wahl, um zelluläre Bestandteile aus Bakterien, Hefen, Pilzen oder Mikroalgen zu extrahieren, und wird entweder auf chemischem oder mechanischem Wege durchgeführt. Mechanische Methoden eignen sich besser für Zellen mit zähen Wänden oder wenn Chemikalien die Extraktion beeinträchtigen könnten und daher vermieden werden müssen.

Ein gängiges und wirksames Verfahren ist das Bead Beating, bei dem die Zellen in einer Suspension mit Hilfe von Kügelchen abgeschert werden. Bead Beating kann in kleinem oder großem Maßstab in verschiedenen Fläschchen oder Tubes durchgeführt werden. Eine Möglichkeit ist das Mischen der Suspension mit Beads und die Verwendung eines Vortex-Mixers. Dieses Verfahren ist jedoch langsam und inkonsistent, insbesondere bei einer großen Anzahl von Proben oder langen Aufschlusszeiten. Der Einsatz von RETSCH Schwingmühlen mit Adaptern, die den Prozess automatisieren und ihn schnell, effizient und reproduzierbar machen, führt zu besseren Ergebnissen.

Hier klicken, um das Video anzuschauen

Schwingmühle MM 400 - Aufschluss von Hefezellen*

_{*Das Video zeigt das Vorgängermodell mit identischem Funktionsprinzip.}

^{Erhöhte Reproduzierbarkeit der Gesamtproteinkonzentration nach Zellaufschluss, 7 min in MM 400, 12 min Vortex; Fehlerbalken: % Standardabweichung}

Die MM 400 verarbeitet bis zu 20 Proben in 1,5 oder 2 ml-Eppendorf-Tubes zeitsparend und ohne Kreuzkontamination. Zusätzlich ist ein Adapter erhältlich, der bis zu acht 50 ml Falcontubes aufnehmen kann. Die optimale Kugelgröße für den Zellaufschluss hängt von der Art der Zelle ab; für Bakterien und Hefe werden Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,75 bis 1,5 mm empfohlen, während für Pilze und Mikroalgen kleinere Perlen im Bereich von 0,1 bis 0,5 mm besser geeignet sind.

Für die DNA- oder RNA-Extraktion sind kleinere Einwegröhrchen bis zu 2 ml ideal, während größere Gefäße wie die 50 ml Falcontubes für die Verarbeitung von Proteinen oder Metaboliten gut geeignet sind. Die optimalen Bead-Beating-Parameter variieren je nach Zelltyp. Es kann einige Versuche erfordern, um die besten Ergebnisse zu erzielen. In der Regel sind 30 Sekunden (die meisten Mikroalgen) bis 7 Minuten (Hefen im Allgemeinen) Bead-Beating erforderlich, um die Zellen vollständig aufzubrechen.

Durch die Aufnahme von bis zu fünfzig 2 ml Einweggefäßen erhöhen Schwingmühlen wie die MM 500 vario effektiv den Probendurchsatz.

Zellen von Phaeodactylum tricornutum vor (links) und nach dem Zellaufschluss (rechts) mit der Schwingmühle MM 400 in Kombination mit dem Falcontube-Aapter.

Temperaturkontrolle für Bead Beating in Zellsuspension

Die Temperatur spielt eine entscheidende Rolle, insbesondere bei Anwendungen, bei denen temperaturempfindliche Proteine beteiligt sind. Eine Lösung ist die Kryogenvermahlung (siehe entsprechender Abschnitt), die andere die Kühlung der Zellsuspension.

Für die MM 400 hat sich gezeigt, dass der Temperaturanstieg in 2 ml Röhrchen selbst bei 30 Hz moderat ist; eine einfache Möglichkeit besteht darin, Pausen von mehr als 1 Minute einzulegen, in denen der Adapter mit den Röhrchen eine Minute lang in einem Eisbad gekühlt wird. Auf diese Weise bleibt die Temperatur unter 12-15°C, abhängig von der verwendeten Kugelgröße.

^{Temperaturanstieg während des Zellaufschlusses in der MM 400 (bei 30 Hz) oder mit einem Vortexer, Abkühlung auf Eis nach jeder Minute Zellaufschluss}

Eine Möglichkeit zur Steuerung der Temperaturentwicklung beim Bead Beating ist die Schwingmühle MM 500 control. Ein spezieller Adapter nimmt achtzehn 2-ml-Einwegfläschchen pro Charge auf. Die Maschine ist an einen Kühler mit 4°C gekühltem Wasser angeschlossen, der wiederum den Adapter kühlt, der die Fläschchen aufnimmt. Auf diese Weise wird die Temperatur der Suspension auf ca. 13°C gehalten, ohne die lästigen manuellen Unterbrechungsphasen in einem Eisbad. Die MM 500 control kann zwar nicht mit dem Einweg-Falcontube-Adapter betrieben werden, aber mit Edelstahl-Mahlgefäßen mit einem Volumen von 50, 80 oder 125 ml (siehe Beispiel links: P. pastoris).

Wird die Mühle mit Flüssigstickstoff und dem CryoPad betrieben und auf eine Temperatur von 0°C eingestellt, kann die Temperatur der Zellsuspension in 2 ml Einwegröhrchen sogar auf 0°C gehalten werden, ohne die Suspension einzufrieren, so dass ein effektives Bead Beating weiterhin möglich ist.

Homogenisierung von weichen und zähen biologischen Proben

Bei einigen biologischen Proben, wie z. B. Sputum von Mukoviszidose-Patienten oder Gewebeproben wie Leber, Lunge oder Tumoren, ist es manchmal schwierig, sie vollständig zu homogenisieren. Die 2-ml-Einmalgefäße sind oft zu klein, um das gesamte Probenvolumen aufzunehmen, so dass die Probe nach dem Homogenisierungsprozess geteilt und wieder zusammengeführt werden muss, was zusätzlichen Arbeits- und Zeitaufwand für die Laboranten bedeutet.

Größere Mahlbecher aus Edelstahl zum Beispiel können das gesamte Probenvolumen aufnehmen, müssen aber nach jedem Gebrauch gereinigt werden. Ein Adapter für die Schwingmühle MM 400 löst dieses Problem, indem er die Verwendung von 5 x 5 ml Einwegröhrchen ermöglicht, die mehr Kapazität haben und nicht gereinigt werden müssen. Pro Charge können 10 Proben gleichzeitig homogenisiert werden. Für die Homogenisierung von Gewebeproben können auch 50 ml Falcontubes verwendet werden. Hier können 8 Proben pro Charge in nur wenigen Minuten verarbeitet werden.

Leberprobe vor und nach der Homogenisierung in der MM 400

Kryogene Vermahlung biologischer Proben

Einige biologische Proben, wie faserige Pflanzen, zähe Venen, Fingernägel oder Tier- oder Tumorgewebe, lassen sich in einem Puffersystem nur schwer homogenisieren. Sie sind entweder zu weich, zu hart oder zu faserig, um in der Suspension effektiv pulverisiert zu werden. Eine bessere Alternative für diese Proben ist die kryogene Zerkleinerung, bei der sie vor oder während der Vermahlung mit flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Diese Technik versprödet die Proben, die sich dann leicht zu homogenen Pulvern zerkleinern lassen. Die Kryogenvermahlung hat auch den Vorteil, dass z. B. Proteine oder flüchtige Verbindungen, die sich bei höheren Temperaturen zersetzen oder verdampfen könnten, unversehrt bleiben. Außerdem ermöglicht die Vermahlung bei tiefen Temperaturen die intrazellulären Organellen einiger Organismen, wie z. B. Hefe, aufzubrechen.

Bei klebrigen Proben, wie z. B. Beeren, ist die kryogene Zerkleinerung oft die einzige praktikable Methode, um eine homogene Probe zu erhalten. In der Tabelle sind einige Beispiele von Probenmaterialien aufgeführt, die erfolgreich durch kryogene Vermahlung in der Schwingmühle MM 400 oder der CryoMill bearbeitet wurden. Für die Kryogenvermahlung in der MM 400 können 2-ml-Stahlgefäße verwendet werden. Ähnliche Effekte lassen sich in der MM 500 control mit Mahlbechern bis zu 125 ml für größere Probenmengen erzielen. Hier muss das CryoPad verwendet werden, um mit flüssigem Stickstoff zu arbeiten. Für kleinere Probenvolumina sind für alle genannten Mühlen auch 2 ml Edelstahlgefäße mit den entsprechenden Adaptern erhältlich.

^{2-ml Reaktionsgefäße aus Edelstahl}

Probe	Zubehör	Aufgabemenge	Mahldauer	Geschwindigkeit	Max. Endfeinheit (d90)/
E. coli Bakterien	2 Mahlbecher aus Edelstahl 50 ml 2 Mahlkugeln 25 mm aus Edelstahl pro Becher	2 x 10 ml gefrorene Zellpellets	2 min	30 Hz	vollständiger Zellaufschluss
Muskelgewebe	Mahlbecher 50 ml, rostfreier Stahl Mahlkugel 25 mm, rostfreier Stahl	10 g	4 min	25 Hz	<150 µm
Kiefernnadeln	2 Adapter für jeweils zehn 2 ml Reaktionsgefäße Je Gefäße zwei Mahlkugeln 5 mm, rostfreier Stahl		3 min	30 Hz	Reproduzierbare RNA-Extraktion aus 20 Proben in einem Schritt
Beeren	Mahlbecher 50 ml, rostfreier Stahl 4 Mahlkugeln 15 mm, rostfreier Stahl	2 g	40 secs	20 Hz	<200 µm
Fingernägel	Adapter CryoMill für 4 x 2 ml Gefäße Je Gefäß 4 Mahlkugeln rostfreier Stahl 5 mm	1 Fingernagel pro Gefäß	2 min	25 Hz	<200 µm
Ratteninnereien	Mahlbecher 35 ml, rostfreier Stahl 1 Mahlkugel 20 mm rostfreier Stahl,	1.8 g	2 min	30 Hz	<150 µm

^{Fleischstücke vor und nach der Kryogenvermahlung}

^{Klebrige Beeren vor und nach der Kryogenvermahlung}

^{Kiefernnadeln vor und nach der Kryogenvermahlung}

^{Agarosegel für die RNA Separation aus den homogenisierten Kiefernnadeln; hohe Reproduzierbarkeit, ausreichende Menge von aufbereiteter RNA}

Forensiche Proben

Forensische Proben wie Haare, Knochen und Zähne sind meist spröde und müssen daher vor der Pulverisierung nicht gekühlt werden. Um die gewünschte analytische Feinheit zu erreichen, müssen die Proben gegebenenfalls in einem Backenbrecher oder einer Schneidmühle vorzerkleinert werden, um ihre Partikelgröße zur weiteren Verarbeitung in einer Kugelmühle auf unter 10 mm zu reduzieren. Schneidmühlen werden zur Vorzerkleinerung von Knochen eingesetzt, die frisch und nicht ganz trocken sein können und sogar Fleischreste enthalten.

RETSCH bietet eine Reihe von Schneidmühlen für die Vorzerkleinerung von weichen, mittelharten, elastischen, zähen und faserigen Probenmaterialien an. Das umfangreiche Zubehör ermöglicht eine optimale Anpassung an unterschiedliche Anwendungen. Die SM 300 kann mit drei verschiedenen Rotoren und Bodensieben von 0,25 mm bis 20 mm ausgestattet werden. Im Gegensatz zu frischen und fetten Knochen können trockene Knochen in einem oder zwei Schritten auf eine Größe von weniger als 0,25 mm zerkleinert werden. Die SM 300 verfügt über eine variable Drehzahl von 100 bis 3.000 min^-1. Die weitere Zerkleinerung von Knochen, Zähnen oder Haaren erfolgt meist in Kugelmühlen mit Mahlkugeln > 5 mm aus Stahl, Zirkonoxid oder Wolframkarbid.

^{Knochenprobe vor und nach der Zerkleinerung in einer Schneidmühle}

^{Menschliches Haar vor und nach der Zerkleinerung in einer Schwingmühle}

Verfahren zur Gewinnung intakter Bakterienzellen aus Humangewebe

Eine der möglichen Komplikationen bei Gelenkersatzoperationen, z. B. an Ellenbogen oder Knien, ist die Infektion des umliegenden Gewebes durch Bakterien. Diese Infektionen, die als Protheseninfektionen (PJI) bezeichnet werden, können einige Tage bis mehrere Jahre nach der Operation auftreten. Sie sind schwer zu behandeln, da sie von verschiedenen Bakterientypen verursacht werden können und mit herkömmlichen Methoden nicht immer erkannt werden. Daher ist es notwendig, die Bakterien aus den Gewebeproben so zu isolieren, dass ihre Lebensfähigkeit erhalten bleibt und sie sich identifizieren und kultivieren lassen.

Hier kann die Schwingmühle MM 400 mit einem einfachen Verfahren helfen: Die Proben werden mit 20 ml sterilem demineralisiertem Wasser und 5 ml 1-mm-Glasperlen in einem sterilisierten Stahlgefäß gemischt. Es können 30-ml-Weithalsflaschen für den einmaligen Gebrauch verwendet werden. Bis zu 8 Flaschen werden 3,5 Minuten lang bei 30 Hz geschüttelt, um die Bakterien aus den Proben zu entfernen, ohne sie zu zerstören. Die Bakterien lassen sich dann leicht auf einer Agarplatte für die weitere Analyse züchten. Diese Methode hat eine hohe Nachweisrate (A.-L. Roux et. al 2010) und kann auf jede feste infizierte Gewebeprobe angewendet werden, auch wenn sie implantiertes Material enthält.